1.4.1ABTS——分光光度计法

　　以ABTS为底物测定漆酶酶活是目前国外较为常见的方法之一。它有如下优点：(1)ABTS易溶于水，在室温下放置6个月仍较稳定。(2)其反应只有一步，即从ABTS到它的阳离子自由基。ABTS的阳离子自由基在水溶液中呈浅蓝绿色，且比较稳定，通常在几个小时或几天之内是稳定的。(3)在漆酶的作用下，ABTS有色溶液的摩尔吸光系数较高，说明以其为底物测定的灵敏度较高。(4)到目前为止，还未有报道称ABTS有致癌作用、诱变作用或是强烈的毒性。

　　WolfendenandWilson分别对5mmol/LABTS加入20μmol/L的抗坏血酸盐的测定溶液，于不同波长进行了光谱扫描，发现纯ABTS呈浅蓝绿色，且在415nm处有吸收峰;而加了抗坏血酸盐的溶液为无色，在415nm处无吸收峰。ABTS的较大吸收峰在340nm，ABTS的阳离子自由基的较大吸收峰在415nm.由此推断，在ABTS的溶液中含有较少的ABTS阳离子自由基，它们在更强的还原剂作用下被还原为ABTS。以ABTS为底物进行漆酶的定量分析，通常在420nm下测定3min内吸光度的变化。用这种底物进行定量分析有一个缺点，即ABTS阳离子自由基溶液的吸光度受溶液中未反应的ABTS浓度的影响。这就产生了一个问题：420nm下的摩尔吸光系数36000L/(mol•cm)是在纯ABTS阳离子自由基的条件下求得的，而在实际测定反应中，ABTS是过量的，这就导致人们低估了酶活。这种影响不能忽视，因为反应终止时，溶液中至少还要有1mmol/L的ABTS。尽管用ABTS为底物存在上述问题，但是它仍是漆酶酶活测定的较好底物之一。一般以ABTS为底物，采用Glycine2HCl缓冲体系、乙酸2乙酸钠缓冲体系或柠檬酸盐2磷酸盐缓冲体系。如果菌种产生过氧化氢，为了准确测定，需加入一定量的过氧化氢酶，用以破坏过氧化氢。因为在代谢过程中，菌体自身产生过氧化氢可激发木质素过氧化物酶与锰过氧化物酶对ABTS的氧化。

　　1.4.2丁香醛连氮——分光光度计法

　　丁香醛连氮(Syringaladazine)也是漆酶酶活测定较为常见的底物之一。以丁香醛连氮为底物是将其氧化为相应的醌，它的摩尔吸光系数为65000L/(mol•cm)。其摩尔吸光系数较大，可见用它定性测定漆酶的酶活具有较高的灵敏度。采用McIlvaine缓冲体系(pH=5.0)，在525nm处测定吸光度的增加。

　　1.4.3二茂铁——分光光度计法

　　以二茂铁(Fe2H)为底物的反应方程式：Fe2H+e2Cu2+e2Cu++[Fe2H]+e2Cu++4H++O2=e2Cu2++2H2O-[Fe2H]溶于水，呈蓝色，在617nm处出现特征吸收峰，Fe2H不对其发生干扰。因此，以二茂铁为底物，用分光光度法测定漆酶活性准确度较高，重复性较好。由于二茂铁不溶于水，因此季立才等选亲水性和疏水性都较好的DGBE作溶剂，与0.1mol/L磷酸盐缓冲液以1∶5体积比混合后，使二茂铁以一定浓度溶解，同时保持漆酶活性。季立才等从生漆中分离、纯化漆树漆酶，并经CM2SephadexC50柱层析，得蓝色酶液Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ3个组分，以二茂铁为底物，用DGBE2磷酸盐缓冲液(pH=8.0)，在617nm处测定吸光度的增加。该方法无副产物干扰，简便、准确、易行。但目前使用并不广泛，故用这种方法测定的酶活力的可比性不高。.还有其它一些用于漆酶酶活测定的底物，无论用哪一种底物进行测定，都有其自身的优势和不足。

　　1.4.4微量热法

　　望天志采用LKB22107Batch型微量热系统，在温度为298.15K，pH=7.4的条件下，测定了漆酶催化氧化底物3，4，5-三羟基苯甲酸、邻苯三酚、邻甲氧基酚的活性，用磷酸二氢钠和磷酸氢二钠配制成pH=7.4的缓冲液。该法操作简单，所用样品量少，不需要光学透明的样品，对酶的悬浮液也能直接测定，对反应体系没有任何限制或干扰。

　　1.4.5脉冲激光光声法

　　阎宏涛等采用脉冲激光光声法测定了漆酶酶活。试验了入射激光能量、激光照射时间和温度变化等因素对漆酶活性的影响;建立了测定漆酶的光声分析方法，检测限为3μg，是一种高灵敏度的生物样品分析方法。

　　3.3.1ABTS法测酶活

　　3.3.1.1主要试剂与仪器

　　主要试剂：

　　⑴1mmol/LABTS溶液，ABTS为美国Sig2ma公司产品，称取0.0274gABTS，用蒸馏水定容至100mL，置于棕色瓶备用;

　　⑵Hac-NaAc(pH4.5)缓冲溶液，18gNaAc，9.8mlHAc，用蒸馏水定容至1L，用pH计校准其pH值。

　　主要仪器：

　　⑴UV-2100型紫外-可见分光光度计，UNICO尤尼柯(上海)仪器有限公司;

　　⑵DELTA320型pH计，METTLERTOLEDO梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司。

　　3.3.1.2漆酶适pH值的测定方法

　　在25℃时，以2mLBritton2Robinson缓冲溶液，外加1mL用蒸馏水稀释104倍的漆酶液为空白;先设定参数，使吸光度自动归零。取1mL相应pH值的Britton2Robinson缓冲溶液，用蒸馏水1mL稀释104倍的漆酶液，再加1mL的1mmol/LABTS溶液于比色皿启动反应，同时用UV-2201型紫外-可见分光光度计的TIME2COURSE程序记录吸光度在420nm波长处4min内的时间历程，取该曲线较初部分的斜率为酶反应的速度，酶反应速度较大时对应的pH值为漆酶的较适pH值。

　　查文献知漆酶酶活较适pH为4.5。

　　3.3.1.3漆酶稀释倍数及酶活力的测定方法

　　取酶液0.1ml，加入Hac-NaAc(pH4.5)缓冲液2.5ml，混匀，加入ABTS0.4ml，放置30s，每15s读取一次420nm下吸光值。共读取6～7个数值。以经验判断，若吸光值增长迅速，则将酶液稀释2～5倍再次测定，直至吸光值数值变化不是太快，且数值均在0.2～0.8之间。酶活的计算：吸光度变化的斜率×4000×稀释倍数。